unicycler

　unicyclerは、バクテリアゲノムに特化したアセンブラーで、short readとlong readのhybrid assemblyを目的として使用する。
　使用例を以下に示す。尚、下準備として、作業環境の整備とトリミングが必要となる。都合上、一部を省略している。作業環境の整備およびlong readのトリミングに関してはcanuの項目を参照。

fastpによるトリミングとquality check

fastpによるトリミング

(base) ~ % cd Desktop/3D_bioinformatics/DATA/short_reads/novaseq_raw #作業ディレクトリをnovaseq_rawに
(base) novaseq_raw % cp AC18_1.fastq.gz AC18_2.fastq.gz　/Users/ocumbacteriology/Desktop/3D_bioinformatics/WD/data/short_reads #ファイルを作業用ディレクトリ（ここではshort_reads）にコピーする
(base) novaseq_raw % cd ..../WD/data/short_reads #作業ディレクトリをshort_readsに
(base) short_reads % % seqstats AC18_1.fastq.gz #AC18_1.fastq.gzの中身を確認
(base) short_reads % mkdir fastp1 #fastp1というディレクトリを作成
(base) short_reads % cd fastp1 #作業ディレクトリをfastp1に
---- トリミング前後のクオリティが表示されるが、結果の表示は省略 ----

-i: input1, -o: output1, -I: input2, -O: output2
-h: html形式で結果を出力することを指定
-j: json形式で結果を出力することを指定
-q: クオリティートリミング　今回はクオリティーの高いショートリードのデータなので30に設定
-n: 最低塩基数の指定
-t, -T: input1およびinput2の3’末端を指定塩基数（今回は3塩基）トリミングする
-l: リードの最低長を指定　今回20 bp
-w: thread数の指定

quality check

(base) ls #fastp1の中身を表示
AC18_1_trimmed.fq.gz report.html
AC18_2_trimmed.fq.gz report.json
(base) fastp1 % seqstats AC18_1_trimmed.fq.gz #AC18_1_trimmed.fq.gzファイルの状況を確認
Total n: 15844552
Total seq: 2344377518 bp
Avg. seq: 147.96 bp
Median seq: 148.00 bp
N 50: 148 bp
Min seq: 31 bp
Max seq: 148 bp
(base) fastp1 % seqstats AC18_2_trimmed.fq.gz #AC18_2_trimmed.fq.gzファイルの状況を確認
---- 1と同様の結果が表示されるが、結果の表示は省略 ----

unicyclerによるハイブリッドアセンブリ

(base) ~ % cd /Users/ocumbacteriology/Desktop/3D_bioinformatics/WD # 作業ディレクトリをWDに
(base) WD % mkdir unicycler # unicyclerディレクトリを作成
(base) WD % cd unicycler # 作業ディレクトリをunicyclerに
(base) unicycler % conda activate unicycler # unicyclerという仮想環境を活性化（unicyclerも仮想環境にインストールしてある）
(unicycler) unicycler % unicycler -1 ../data/short_reads/fastp_-t-T_-3_-5/out_pair1.fq. -2 ../data/short_reads/fastp_-t-T_-3_-5/out_pair2.fq -l ../data/long_reads/Ac18_trimed.fq -o output --mode bold

unicyclerによるハイブリッドアセンブリの実施
-1: 1つ目のSRSのトリミング後のファイル
-2: 2つ目のSRSのトリミング後のファイル
-l（小文字のエル）: LRSのトリミング後のファイル
-o: アウトプットのディレクトリ名（任意に決められるが、今回はoutputにしている）
--mode bold: 条件をboldにしている（アセンブルの精度とcontiguityの設定。defaultではブリッジのクオリティの閾値は10だが、conservativeでは25になる。同時にショートリードをブリッジ情報として使われなくなる。boldでは反対にcutoffの値が最低の1まで下がり、ショートリードもブリッジ情報として利用される）。
long readのファイル（ここでは、../data/long_reads/Ac18_trimed.fq）は、canu項目で準備したもの。